液-液相分离（Liquid-liquid phase separation，LLPS)是指大分子（如蛋白质、核酸等）在溶液中，凝聚浓缩成液滴状（droplet）从而形成密相，发生相分离，并与轻相共存的现象称为LLPS。LLPS是生命体的关键进程，在细胞中，相分离是分子间（蛋白质、RNA等）由弱相互作用的聚在一起形成大小不一的、独立的液滴，在显微镜下呈现出“油滴”状。并将其与周围的环境“隔离”，形成droplet，方便了分子之间快速地进行化学反应。]他们可以从液体逐渐转变为固体，形成无膜细胞器，如核仁、应激颗粒、中心体等[2]；也可以随着环境的改变，从液滴状恢复成游离状态。正常状态下，大多数LLPS是可逆的，其形成条件取决于大分子浓度、分子特性、温度、pH值、共溶质等。如图A，在低浓度下，无论条件如何改变，LLPS都不会发生；随着大分子浓度的增加，溶液可能进入两相状态，改变温度、pH等条件时，两相转变可能发生[1]。
有研究表明LLPS失调与ALS[3][4][5][6]、白内障[7][8]、神经退行性疾病[9][10][11]等相关。例如，在健康人体内，当运动神经元受到温度、化学物质和其他环境因素的压力时，会形成液滴状的应激颗粒，可以随着环境的变化而消失。然而，在ALS 患者中，这种颗粒呈固体状，不会随着环境的改变消失。这提示这我们，通过干扰异常的LLPS使其恢复正常，或许可以为治疗这些疾病提供新的思路。
LLPS通常在体外进行研究，常用的表征方法有荧光显微法、浊度法及微流控技术、FRAP等。这些方法在研究体外LLPS时，或多或少都存在着一些限制性和挑战。以FRAP为例：FRAP利用激光将将样本漂白，然后在该区域恢复时检测该区域的荧光，如果相分离的droplet是液体状的，则荧光回收率很快；若相分离的droplet凝胶状液滴中的荧光恢复缓慢，光漂白后蛋白聚集物中的荧光信号无法恢复，根据不同组分的恢复时间差异来评估droplet的流动性。然而FRAP的恢复时间与液滴的稀释度、光漂白的液滴大小、内部流动性、光漂白区域的大小等，导致其在LLPS的研究中有一定的限制性，同时它不能作为确定某一结构形成LLPS的依据。
FIDA在LLPS表征上的应用
丹麦技术大学联合Fidabio公司提出了一种全自动高通量的方法-Capflex，这种方法仅需一台FIDA 1仪器即可完成，一次可测96个样品。通过检测荧光强度（内源荧光、YEP和Alexa488等），能够直接表征轻相中的分子浓度、droplet的size分布、形成动力学（何种条件下发生分离），以及产生LLPS时相关分子间的结合亲力。
–表征轻相浓度
样品检测前，利用FIDA 1的控温系统将样品温度控制在浊点之上，防止LLPS发生。样品进入毛细管（内径75μm，长度1m）后，控制温度在浊点之下，将样品溶液充满毛细管（3500mbar，40s），随后溶液以200mar的压力压入毛细管，540s。当液体经过探测器时，记录荧光信号值，droplet经过检测器会产生峰值（Signal spike），而轻相经过检测器时，记录的荧光信号值低，形成荧光信号值的basline。Basline越低，表明轻相浓度越低，LLPS程度越高。
pH、配体等），确定从一个阶段到另一个阶段的过渡点，为LLPS的相分离提供可靠的判断性依据例如，可以利用Capflex在固定温度、pH等条件下，通过设置检测样品的浓度梯度，可以检测到样品发生LLPS的关键浓度以及在不同浓度下，样品LLPS的程度
表征Droplet大小分布和形成动力学
Droplet尺寸与峰值信号强度有关，因此峰值信号强度可以用来确定droplet的大小分布及中位数。Ddx4是nuage和germ granules的主要成分[12]，其n1结构域 (Ddx4n1)被证明发生LLPS时是可逆的[13][14]，是研究LLPS很好的蛋白质模型。Ddx4能够partition 单链DNA（ssDNA），利用Capflex研究DNA对LLPS的影响，发现在ssDNA的作用下，Ddx4n1的droplet大小分布的中位数和广度随ssDNA浓度的增大而减小，表明ssDNA会减少droplet的形成。
PEG在本实验中作为molecular crowder能够诱导LLPS发生。随着PEG3000浓度的增加，同一反应条件下对Ddx4n1形成LLPS的驱动力增大，平均峰强增加得更快，在1.5 min后达到最大峰值。
-表征配体对LLPS的影响
Fida 1具有内置的结合亲力测量功能，能够研究配体对LLPS的影响。
本实验测定了ssDNA与Ddx4n1和合成RP3肽（被用作为无膜细胞器模型，能与ssDNA形成凝聚）的结合亲力。结果凸显出了ssDNA分别与Ddx4n1和RP3之间相互作用强度的差异。与Ddx4n1不同，随着PR3浓度的增加，ssDNA水动力半径逐渐减小，表明DNA结构发生了强烈的崩溃，显示了RP3肽对负电荷DNA的强烈中和作用。
总结
Capflex是一种新的、全自动表征LLPS的新方法。只需要一台FIDA 1仪器，通过检测荧光强度，就能够判断相分离、测量轻相浓度、droplet大小分布、droplet形成动力学，这是其他荧光检测方法难以实现的。同时FIDA 1可以测量分子的水动力半径，从而计算LLPS下分子间的结合亲力，因此Capflex可应用于生物学相关的蛋白质和肽模型系统，这对LLPS的研究、LLPS失调而引发的疾病及其治疗靶点具有重要价值。