Fidabio的主要优势：
•测量外泌体的大小和亲和力
•定量未知样品中外泌体的浓度
•可在培养液中直接检测，仅需微量样品数据可靠
•内置质量控制模块
前言
外泌体是从细胞中释放出的一种胞外囊泡，含有如蛋白质、DNA和RNA等胞内成分，充当着向其他细胞传递某些遗传信息的载体（1）。外泌体在细胞间的通讯可能发生在正常细胞和异常细胞之间，也可能发生在不同组织的细胞之间。研究表明，外泌体在免疫应答，病毒侵染，妊娠，心血管疾病，神经系统退行性疾病，癌症等进程中均发挥重要作用。因此，外泌体在临床诊断和细胞治疗领域的应用研究方兴未艾（1）。在本应用报告中，展示了使用FIDA（流动诱导分散分析）技术测定外泌体的大小（流体力学半径，Rh），定量浓度，以及测量其与相关分子间的亲和力。FIDA是一种基于毛细管的技术，在溶液中自然条件下测量生物分子间的结合亲和力和复合物的粒径（流体力学半径，Rh）（2,3,4）。本研究利用抗CD81抗体和抗外泌体抗体，分别检测外泌体在缓冲液和用过的培养基（细胞培养液）中的结合亲和力，以cholesterol -topfulor作为指示剂（indicator）测量外泌体的大小。
材料与方法
Fida-1仪器，488nm激光诱导荧光检测，Fida标准毛细管（内径：75µm，LT:100cm，Leff:84cm）。样品分析，先用4 µL外泌体溶液充满毛细管，随后注入39 nL抗体，在25°C，pH7.4，50 mbar 压力下随外泌体溶液向检测器移动27分钟。亲和力分析，在固定浓度的抗体和指示剂的条件下（10 nM抗CD81抗体,1000 nM cholesterol-Topfluor抗体和100nM抗exosome抗体），分别用一系列梯度浓度的外泌体分别进行测定。使用专用FIDA软件进行数据分析。
结果
抗CD81抗体与外泌体结合
FIDA技术可以测量特定结合物（抗CD81抗体）和感兴趣的分析物（外泌体）相互作用时分子大小的绝对值（即流体力学半径，Rh）。游离的抗CD81抗体的Rh测得为5 nm，与通常的一个抗体分子的大小一致。在缓冲液（图1）和使用后的培养基（图2）中用不同梯度浓度的外泌体溶液分别滴定测量，随着外泌体溶液的浓度增加，抗CD81抗体在两种溶液环境下的表观大小都有所增大，抗体和外泌体复合物的大小测定为44.3-51.3 nm。测定的表观KD值，在缓冲液（60.4）和细胞培养液（73.5）中一致性良好，表明本方法能够在培养液等自然条件中直接检测，并有良好的重复性。
图1。A) Anti-CD81的原始数据，作为外泌体浓度的函数。B)作为外泌体浓度函数的Anti-CD81结合曲线，用结合百分比表示。
图2。A） Anti-CD81的原始数据，作为10 %培养液中外泌体浓度的函数。B）相关结合曲线，用结合百分比表示。
结合曲线是量化外泌体相互作用的有效方式，可对外泌体进行全面的功能表征。此外，结合曲线也可用于直接在培养液中对特定分析物如IgG进行定量（5）。
我们在近期的一个实验中，引入了一个快速超滤步骤，让定量范围增加了一个数量级（图3）。作为一个概念验证实验，应用本方法可以在培养的早期阶段，直接在培养液中定量外泌体浓度。
图3。A） Anti-CD81的原始数据，作为有或无经过超滤的10 %培养液中外泌体浓度的函数。B）相关的结合曲线，描述有经超滤的结合百分比。
抗外泌体抗体与外泌体结合
抗外泌体抗体的流体力学半径测定约为5 nm，与预期的抗体大小一致。随着外泌体的浓度逐渐增加，抗体指示剂的大小显示逐渐增大。从原始数据（图4）中可以直接观察到这一点：外泌体浓度的增加导致游离抗PTGFRN（窄峰）减少，同时与外泌体相结合的抗PTGFRN（宽峰）增加。根据图3B中的结合等温线可确定抗外泌体抗体与外泌体之间的表观亲和力（KD）为1E10 p/mL，复合物大小（Y轴流体力学半径）则测定为103 nm。
图4。A）在20 % v/v培养液中，anti-PTGFRN的泰勒图原始数据作为外泌体浓度的函数。B）相关的结合等温线曲线，作为外泌体浓度的函数以流体力学半径表示。
在0-90% v/v培养液中，观察抗外泌体抗体的流体力学半径（大小），评估潜在的样品杂质的干扰。在这里，我们发现抗PTGFRN的表观大小在用不同浓度培养基测量的整个过程中没有显著变化，见下表。
结果表明，抗PTGFRN抗体不与培养液中其他的组分发生相互作用，甚至可在培养基原液中直接检测与外泌体的结合。
表1: 在0-90 % v/v培养液中测得的抗PTGFRN抗体指示剂的大小。
外泌体大小测定
将Cholesterol-topfluor作指示剂，测量外泌体大小。在没有外泌体存在时，Cholesterol-topfulor不溶于水溶液。当添加到外泌体溶液中时，cholesterol-topfluor则可溶解在外泌体的膜上，从而产生信号。该方法也是测定溶液中外泌体大小的通用方法。在这里，我们检测到外泌体的平均流体力学半径为115 nm，该值与用抗外泌体抗体检测时所得的结果完全一致。
图5。1000 nM Cholesterol–topflour在5.8E12p/mL外泌体溶液（20 % v/v培养液）中的原始数据。橙色线是原始数据，蓝色线是计算流体力学半径的数据拟合。
结论
FIDA技术能在培养液等自然条件直接检测外泌体和外泌体-配体复合物的大小和亲和力。此外，该技术在定量未知样品中外泌体浓度具有潜在的应用价值。在近期开发的方法中，我们进一步提高了定量的灵敏度和范围。欲了解更多详情，请和我们联系。