利用FIDA技术分析泛素化的优势：
1.检测快速，15到30min即可完成。
2.溶液中自然条件下检测。
3.无人值守自动化检测，无需预实验。
简介
泛素化（Ubiquitination）是最重要的蛋白翻译后修饰的调控机制之一，在真核细胞中普遍存在，参与调控蛋白稳定性、蛋白降解，以及膜转运和转录等过程。泛素化需要三个重要的酶：泛素激活酶E1, 泛素结合酶E2和泛素连接酶E3 (1,2)，这些酶在自然界中存在许多变异体，针对不同的靶蛋白而具有特异性。本应用报告提供了一种使用FIDA技术快速测定蛋白泛素化的方法。FIDA是一种毛细管技术，在溶液中测量生物分子间的结合及复合物大小（in-solution binding and complex size）。
本文研究基于P53泛素化的模型系统，与传统或商业化的泛素化检测方法（如SDS-PAGE 和Western Blots）相比，FIDA只需很少的样品即可快速地得到结果。
图1. FIDA检测泛素化原理示意图。
材料和方法
FIDA 1仪器（480 nm LED荧光检测）(Fida Biosystems ApS)和FIDA标准毛细管(i.d.: 75 µm, LT: 100 cm, Leff: 84 cm)；HEPES 缓冲液, pH 7.5, 500mM NaCl, 10mM TCEP 用于工作缓冲液；将终浓度分别为100nM, 50nM, 1uM,1uM 和10mM的P53, E1, E2, E3 和ATP在小瓶中混匀。
加入不同的浓度的泛素用以控制泛素化的程度。1 uM荧光标记的泛素（fl-Up）作为追踪标记，分别孵育15分钟和1小时；分散分析：先将4uL分析物analyte（buffer）注入毛细管中，然后注入39 nL 带有 fl-Ub指示剂（indicator）的反应混合物，在400mbar压力下向检测器移动进行分析。
结果
Fl.Ubiquitin大小的测定
FIDA技术是用标记的分子（indicator）来测量分子或分子复合物的绝对大小（流体动力学半径）。在本试验中，fl-Ub作为指示剂（indicator），检测所得fl-Ub的流体动力学半径是1.8nm。
实验设计
在泛素化反应中加入1uM的fl-Ub作为指示剂（indicator）。P53蛋白泛素化反应检测：加入所有相关酶（E1、E2、E3）、ATP、fl-Ub和未标记（游离）的泛素，fl-Ub大小的增加即可证实P53的泛素化（图1）。
用不同浓度的未标记泛素检测P53泛素化反应，评价和预测泛素化程度。分别在37℃下孵育15分钟和1小时。阴性对照实验：不添加ATP，确保在给定条件下不发生泛素化反应。
结果显示，阴性对照组中fl-Ub的大小没有变化；而在阳性反应中，添加20uM和50uM的游离泛素时，fl-Ub的大小从1.8nm分别增加为16.6nm和18nm（图2，表1）。
已知在37℃条件下，完全泛素化在10-15分钟内即可完成。本实验中，孵育15分钟后检测，大小发生显著变化；孵育1小时后未观察到复合物大小继续增加（表1）。
图2: A）阴性对照：不添加ATP，其他成分都添加的泛素化反应。B）添加所有成分，及20uM游离的泛素。C）添加所有成分，及50uM游离的泛素。
表1：在P53泛素化的过程中fl-Ub大小增加。单独的fI-Ub的大小测量为1.81nm。可以看出阴性对照中fI-Ub的大小没有增加（没有ATP，没有结合），表明只有在P53泛素化时才会发生fl-Ub大小的增加。
结论
FIDA可以快速简便地检测目的蛋白的泛素化反应，与传统方法（SDS-PAGE 和Western Blot）相比，该技术可以实时监测泛素化反应过程，且检测快速（15到30分钟），与传统方法相比显著节省了时间。