FIDA技术的独到之处在于，在溶液中仅需少量样品，能够在纳米尺度上检测分子及其复合物的大小尺寸（size）和变化，检测所得为绝对值，准确可靠（可参考下文中的实验数据；往期内容也可见其数据与小角度X光散射法SAXS的结果相一致）。而分子和分子复合物尺寸的大小和变化（size changes）是反映其结构的一个重要参数，而对一些生物大分子如蛋白质而言，其生物学功能就需要建立在相应的三维结构之上。集成入蛋白结构数据库（PDB）的Fida 1系统，如虎添翼，可将检测所得的流体力学半径(Rh）与数据库中X射线、冷冻电镜（Cryo-EM）的结构数据，以及AlphaFold预测所得的结构数据予以精确关联，建立了End-to-end定量的工作流程。
简介
在生物物理学中，分子尺寸大小的变化（size changes）是蛋白和其复合物结构的一个重要的定量参数。若要将蛋白结构与其尺寸大小(如Rh，流体力学半径，也称为水力学半径)关联，需要基于实验或AlphaFold预测所得到的数据，综合去考虑蛋白的结构特征和折叠组装等。[1] 为建立一个确凿可靠的基准（baseline），我们开发了Fidabio PDB (Protein Data Bank) Correlator软件。在下面的例子中，我们用这个软件去预测牛β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）、人血清白蛋白、牛血清白蛋白和鸡溶菌酶（lysozyme）在溶解状态下的Rh(图2)；随后，用配有紫外检测器的Fida1设备测定无标记时这些蛋白的Rh值，并与前述预测值进行比较。实验过程如图1所示。
实验表明，我们在结构数据和溶液中Rh测量值之间建立了精确的关联，本方法亦可对AlphaFold[1]预测的结构结果进行验证。此外，Fidabio PDB Correlator也适用于蛋白有荧光标记时的检测。
图1：Fidabio PDB Correlator工作流程。
FIDA测量原理
FIDA原理:流动诱导分散分析（Flow Induced Dispersion Analysis，FIDA）是一种基于毛细管的微流路检测方法。毛细管中心的流速比边缘快，因此流体在扩散的前端和尾部产生出径向浓度梯度，通过检测其中指示剂（indicator）的荧光信号即可实现“第一原理”的分子生物物理大小尺寸的测量（拓澳编者注：“第一原理”指检测所得为绝对值，意味着无需标准品做对照或需要设备校准，更多原理介绍请参考往期内容），FIDA目前已广泛应用于生物分子稳定性、相互作用等方面的研究。欲了解更多信息，请参考文末“往期链接”。
材料与方法
Fida 1仪器，Fidabio 280nm LED荧光进行尺寸大小检测(Fida Biosystems ApS)。Fidabio标准毛细管(i.d.：75µm，LT：100cm，Leff：84 cm)。
牛β-乳球蛋白(BLG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和鸡溶菌酶(LYZ)分别在缓冲液(1× PBS)中溶解作为指示剂（Indicator）。空白缓冲液则作为分析物（Analyte）。
样品分析：先在毛细管中充满分析物，然后注入经预孵育的指示剂，在400mbar压力下向检测器移动。其中，检测LYZ的毛细管先用HS试剂(Fida Biosystems ApS)做包被。
利用Fidabio PDB Correlator将测得的流体力学半径（Rh）与分子量进行关联。相关晶体结构来自蛋白质数据库(Protein Data Bank，https://www.rcsb.org/)。用PyMOL2.5.0分子三维结构显示软件 (Schrödinger LCC)去除结晶水和共结晶分子，再用该软件做PDB文件清理和可视化（clean up and visualization）。数据分析用Fida软件进行。所有的标准偏差来自9次重复实验的误差。
结果
测量无标记时的Rh，及用利用Fidabio PDB Correlator做结构关联
配有紫外检测器的Fidabio 1仪器能检测无标记时的流体力学半径(Rh)绝对值。分别测定牛β-乳球蛋白(BLG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清蛋白(BSA)和鸡溶菌酶(LYZ)的尺寸大小。已知BLG在pH中性时为同源二聚体，其他pH条件下则为单体蛋白[2-5]。利用Fidabio PDB Correlator，将PDB数据加载到Fida软件中，然后预测其分子量和Rh。对于大的单体蛋白，预测所得分子量与理论值的差异在2%以内(表1和附录)。对于较小的蛋白，当其包含有共结晶的分子结构时，则建议对PDB文件先做Clean up，图2展示了用PyMOL做结构Clean up时的步骤。
表1：几种蛋白的流体力学半径(Rh)的预测值（Predicted Rh）和测量值（Apparent Rh），分子量(m.w.)的预测值和理论值，以及在PDB中的编码。预测值是将Celan up后的PDB文件加载到Fidabio PDB Correlator中生成。测量值则由Fida1测得，误差为9个重复的标准偏差。亦可见附录。
不做Clean up时，LYZ、BSA和HSA的表观Rh与实验Rh的差异均在10%以内，移除共结晶分子后，精度则可达0.3%(理论值与实验数据比值)(表1)。其中BLG的Rh预测值为2.19nm，但实验值却大了28%(附录，表1)，提示其在溶解状态时存在的结构并非单体。将该文件做Clean up并选用一种同型二聚体结构，这样再预测所得的Rh为2.85 nm，与实验值2.77±0.06nm相比，差异在2.8%以内。这表明所测的BLG确为同源二聚体，而这在其他文献中已经被广泛证实[2]。
图2：Fidabio PDB Correlator和用于关联的可视化PDB文件。(A)使用Fidabio PDB Correlator直接从PBD加载BLG(1BEB) PDB文件；(B)使用PyMOL分子可视化系统生成的PDB文件；(C)去除结晶水的PDB文件；(D)去除共结晶分子并用正确的寡聚体状态做Clean up。在本例的特殊情况下，去除共结晶分子后Rh没有出现差异(在C和D两步中，Rh都是2,85nm)。然而，对于许多含有较大的共结晶分子的晶体结构，去除共结晶分子是一个重要的步骤，否则会影响Rh的预测准确性。
结论
实验结果表明，用非常少量的无标记样品(~40 nL/run at 0.1 g/L)，Fida 1就能在溶液中检测出给定蛋白的寡聚状态和流体力学半径。用Fidabio PDB Correlator，则可在蛋白的流体力学半径与其结构数据或AlphaFold预测的结构数据间建立精确的关联(误差<9%)。