Fidabio的主要优势是可在缓冲液和血浆中表征超分子在不同结构之间的转换：
•直接在缓冲液和血浆中快速高效地表征分子
•可得到超低浓度分析物的高质量数据-任何其他技术都难以实现
•数据与小角度X射线散射法（SAXS）相一致
•仅需微量样品
前言
超分子（Supramolecule )是由非共价键而组合成的多分子集团，它可简单到由二个分子组成。它们可以是球形，棒形，或片状样品，尺寸可从纳米到微米的范围。超分子的自组装过程（self-assemble)是使超分子产生高度有序的过程。（请参考后文：什么是超分子？）
本应用报告基于与哥本哈根大学Nikokaj Riis Christensen博士等人合作的研究工作，在缓冲液和人血浆中表征一种潜在的治疗分子(暂命名为mX)的特性。由于分子的化学结构，mX能够自组装（self-assemble）成更高阶的寡聚体结构，因此在不同条件下其结构可在单体、寡聚体和胶束（micelle）之间发生转换。本研究结果表明，即使对于非常低浓度的mX, FIDA也可提供可靠和高质量的数据来表征不同结构之间的转换，而这是其他任何方法都难以实现的。此外，FIDA实验也阐明了mX在血浆中的行为，显示了其与HSA的结合。
材料及方法
采用Fida 1仪器，480 nmLED荧光检测（Fida Biosystems ApS）。Fida标准毛细管(内径:75µm, LT: 100 cm, Leff: 84 cm)进行测定。PBS缓冲液pH为7.5。mX用荧光标记。缓冲液中制备所有样品，上样于Fida 1 480系统中检测，使用单个玻璃瓶或96孔板设置。Fida – 1毛细管分别有HS涂层包被、BSA涂层(19mg/ml)包被，或多鸟氨酸涂层(Poly-Ornithine ，1 mg/ml)包被，以及无包被的毛细管。以下面两种方式运行样品：用缓冲液冲洗毛细管后，在1500 mbar压力下，填充1）分析物(未标记)，或 2）缓冲液，各45秒；然后在50 mbar压力下，单次进样(指示剂，indicator)10秒。然后在400mbar冲洗样品180秒。
结果
mX在溶液中的行为以及与SAXS相比较
在溶液中，mX显示出一种有趣的行为：由于其化学结构，mX可自组装成为高阶的寡聚体结构，其中疏水部分被亲水部分所包裹成为胶束(micelle)。之前使用SAXS（Small Angle X-ray Scattering，小角度X射线散射）进行的研究发现，mX以~23Å的旋转半径(Radius of gyration ，Rg)组装成胶束(图1A, 1B)。
图1:A) SAXS证实mX自组装成胶束结构。B) 最优拟合core-shell 模型的参数，其中Nagg是组成平均胶束的亚基数，Rcore是包含脂尾的核区半径，Rshell则是壳的半径对应于Rg。
然而，SAXS不能提供关于mX的临界胶束浓度(critical micelle concentration ,CMC)的信息。为了更好地评估CMC和mX组装成的寡聚物大小，使用Fida1进行检测。在实验中，mX的示踪剂与配备荧光探测器的Fida1系统结合使用，在低至µM浓度下也能够提供高质量的数据，并且通过结合使用不同涂层的FIDA毛细管和运行一系列梯度浓度的mX获得了CMC值(图2)。
图2:不同浓度的最佳涂层时mX的结合等温线，可得到CMC结果为12µM。使用GraphPad Prism 8.3绘制数据，使用FIDA软件(2.0)对原始数据进行拟合，使用可变斜率的四参数饱和法绘制和拟合出结合曲线，并得出水动力半径（hydrodynamic radii）。
mX在血浆中的行为
作为一种潜在的治疗化合物，mX需要皮下或静脉注射，故而其血浆中的特性是必须要了解的。设想可能有两种结果：mX可以保持在胶束组装体中，从而获得血浆内的稳定性；或者mX也可以与血浆中的蛋白(如人血清白蛋白HSA)结合来达到稳定。我们做了如下测试：
1) mX在溶液中与HSA结合的能力;
2)mX在人血浆中的性质，验证在更复杂的样品基质中是否存在胶束或HAS复合物。
首先，我们发现mX确实可以与HSA结合(图3)。此外，血浆中的优势分子复合物种类的Rh值为~42-47 Å，表明mX在血浆中与HSA结合，而不是形成胶束。
图3: mX与HSA的结合等温线表明，亲和力(KD)为787 nM，复合物的流体力学半径(RH)为4.46 nm。
结论
FIDA可以快速简便地验证mX胶束的形成，Rh为~30 Å，与小角度X射线散射法（SAXS）所得的数据一致。此外，FIDA法能够为mX提供出12µM的临界胶束浓度（CMC）值，这是任何其他技术都无法获得的关键信息。而在人血浆中，mX能以µM的亲和力与HSA结合。综上所述，FIDA有效阐明了mX在溶液和血浆中的行为，提供了潜在治疗复合物的重要信息。
FIDA（流动诱导分散分析）技术原理
图示：Taylor Dispersion Analysis原理示意。
泰勒分散分析 (TDA)是一种微毛细管流技术，可基于溶液对小分子、多肽和蛋白质及混有这些物质的样品进行测定。该分析将纳升级的样本脉冲注入匹配缓冲液的一个层流，样品脉冲流经微毛细管时会因分散（轴向）和扩散（径向）而变宽，沿微毛细管在固定窗口进行的荧光检测用于分析样品脉冲横截面（从 t1 至tn）处的荧光强度，然后通过测量时间浓度曲线（或泰勒图）完成分析。泰勒图中，峰的宽度与样品中溶质的分子分散系数 (D) 相关，从而可以确定流体力学半径 (Rh)。
图示：FIDA（Flow Induced Dispersion Analysis，流动诱导分散分析）原理示意。
FIDA是一种基于毛细管的新技术，利用泰勒分散原理，在压力驱动的流体中精确测定分析物的Rh（流体力学半径）的绝对值，溶液中自然条件下生物分子间的结合亲和力（KD），以及形成的复合物的Rh大小等。检测范围：0.5-1000nm；灵敏度：5%的Rh变化。